Tóm tắt:

95 mẫu giấy thấm thu thập trong đợt điều tra đánh giá hiệu quả của võng tẩm hóa chất có tác dụng kéo dài tại tỉnh Ninh Thuận năm 2004 sau khi được phân tích bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu loài (SS-PCR) cho kết quả dương tính với Plasmodium malariae (đơn thuần và phối hợp) được sàng lọc với Plasmodium knowlesi theo quy trình của Singh.B. 3 mẫu dương tính với P.  knowlesi nhiễm ở một bé trai 2 tuổi, một bé gái 3 tuổi và một thanh niên nam 27 tuổi. SS- PCR cho thấy bé gái nhiễm phối hợp P.falciparum, P.vivax và P.malariae, bé trai nhiễm P.malariae và P.ovale, còn người thanh niên nam thì nhiễm phối hợp P.vivax và  P.malariae. Các mẫu này đều được giải trình tự ADN, đặc biệt em bé gái sau 1 năm vẫn dương tính với P. knowlesi  trong đợt điều tra tháng 12 năm 2005 bằng cả 2 phương pháp PCR và giải trình tự gen. Các trình tự (có kích thước 153 cặp bazơ) thu thập được tại Việt Nam (FJ160750;FJ160751;FJ160752; FJ160753 và FJ871986 ) tương đồng với chủng P. knowlesi của Malaysia  97-99%.

1. Đặt vấn đề

Plasmodium knowlesi (P. knowlesi) được phát hiện lần dầu tiên vào năm 1931 trên khỉ đuôi dài (có tên khoa học là Macca fascicularis), một năm sau đó Knowles và Das Gupta đã thành công trong việc gây nhiễm thực nghiệm truyền P. knowlesi từ khỉ sang người. Khi sống trong cơ thể vật chủ tự nhiên là loài linh trưởng có đời sống tập trung tại các nước trong khu vực Đông Nam Á. P. knowlesi không gây nên các triệu chứng của bệnh sốt rét hoặc nếu có là các triệu chứng ở mức độ nhẹ. Tuy nhiên chúng lại gây ra những triệu chứng ác tính và thậm chí là tử vong khi gây nhiễm cho người qua vật chủ trung gian truyền bệnh là nhóm Anopheles leucosphyrus [1]. Sau phát hiện của Singh. B và các cộng sự năm 2004 từ các trường hợp nhiễm sốt rét tại khu vực Kapit thuộc đảo Borneo, Malaysia,  P.  knowlesi được xem là loài ký sinh trùng sốt rét thứ năm gây bệnh cho người, bên cạnh P. falciparum, P. vivax, P. malariae và P. ovale [2].                        

Trường hợp nhiễm Plasmodium knowlesi  trên người lần đầu tiên được ghi nhận vào năm 1965 ở một nhân viên quân đội Hoa Kỳ trở về nước sau khi công tác tại Đông Nam Á. Những năm sau đó ngày càng có nhiều báo về cáo trường hợp nhiễm Plasmodium knowlesi trên người,  mặc dù phần lớn các ca nhiễm được báo cáo từ những nước trong khu vực Châu Á như Singapore, Thái lan, Malaysia…. nơi có sự sinh sống của khỉ đuôi dài nhưng với sự phát triển của khoa hoc kỹ thuật, du lịch, di dân và mở rộng lãnh thổ,  P. knowlesi đã được tìm thấy ở cả những quốc gia không phải vùng sốt rét lưu hành [3]. Mặc dù trình tự gen của chủng ký sinh trùng này 80% giống với P. vivax và P. falciparum nhưng thể tư dưỡng khi soi dưới kính hiển vi lại giống với P. malariae và ở giai đoạn sớm của chu kỳ phát triển giống với thể nhẫn của P. faliparum. Với chu kỳ phát triển 24 giờ, và tính phức tạp về mặt hình thể, trước đây những trường hợp nhiễm  P. knowlesi  thường  bị chẩn đoán nhầm với P. malariae hoặc P. falciparum hoặc bị bỏ qua khi mật độ ký sinh trùng quá thấp không phát hiện được dưới kính hiển vi.

2.  Quá trình  phát hiện.

Khi tiến hành  điều tra cắt ngang được tại tỉnh Ninh Thuận, miền trung Việt Nam (số lượng dân cư khoảng 20.000 người tại thời điểm nghiên cứu) từ năm 2004 -2006 nhằm đánh giá hiệu quả của võng tẩm hóa chất có tác dụng kéo dài. Các mẫu máu được thu thập bằng mẫu giấy thấm chủ yếu tại khu vực đồi núi và rừng rậm nơi có đồng bào dân tộc Raglai sinh sống.

Các mẫu DNA được tách chiết từ các mẫu giấy thấm sử dụng Saponin theo phương pháp của Plowe CV và cộng sự (12 mẫu trong 1 lần tách chiết trong đó 11 mẫu giấy thấm thu thập tại thực địa  và 1 mẫu chứng âm ở sau cùng) [4].  Các mẫu DNA được sàng lọc nhằm phát hiện 4 loại ký sinh trùng sốt rét trên người bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu loài (SS_PCR) [5]. 95 mẫu dương tính với P. malariae được lựa chọn ngẫu nhiên để sàng lọc P. knowlesi theo quy trình của Singh. B. Primary PCR được thực hiện với tổng thể tích hỗn hợp phản ứng là 50 µl (1x đệm – Qiagen, 3mM MgCl₂ (Qiagen- Đức),200mM mỗi dNTP (Eurogentic-  Bỉ), 250nM mồi mỗi loại bao gồm (rPLU1, rPLU5), 0.1µg/µl BSA (Promega- USA) và 1đơn vị Hosta Taq Plus DNA polymerase (Qiagen) 2µl DNA của đối tượng nghiên cứu. Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng cho  Nested PCR là 25µl (1x đệm – Qiagen, 3mM MgCl₂(Qiagen- Đức) 200mM mỗi dNTP (Eurogentic-  Bỉ), 250nM mỗi loại mồi bao gồm (Pkm8, Pkm9), 0.1µg/µl BSA (Promega- USA) và 2 đơn vị HostaTaq Plus DNA polymerase (Qiagen) 2µl sản phẩm primary PCR. Toàn bộ các hỗn hợp này được khuếch  đại bằng máy luân nhiệt  PTC thermal cycler (Bio-rad, USA) .  5µl sản phẩm khuếch  đại  được phân tích và tinh sạch bằng chạy điện di trên gel agarose 2%, thoiwg gian 60 phút với cường độ dòng điện 5V/cm trong 0.5 X đệm TAE. Gel được nhuộm trong Ethidiumbromide và đọc dưới đèn UV.

Các mẫu máu của thành viên sống trong cùng gia đình của những trường hợp phát hiện nhiễm P. knowlesi trong đợt điều tra cũng được sàng lọc bằng kỳ thuật PCR với loại ký sinh trùng này.

Nhân dòng và giải trình tự gen: Sản phẩm khuếch đại của các mẫu dương tính với P. knowlesi được nhân dòng bằng TOPO cloning kit (Invitrogel- USA) sau đó được nối vào vec tơ pCR4® -TOPO®. AND tái tổ hợp được biến nạp vào chủng Mach1^TM T1^BEscherichia coli. Các trình tự nucleotit của các dòng mang đoạn chèn ứng với P. knowlesi được xác định tại  Geno Screen (Campus de l'Institut Pasteur de Lille 1, rue du professeur Calmette 59000 little cedex, France). Trình tự nucleotide được sắp xếp thẳng hàng và dịch mã thành trình  tự axit amin bằng phần mềm  ClustalW, so sánh với các trình tự AND của P.knowlesi đã được báo cáo tại ngân hàng gen (DQ350263; DQ350262; DQ350261;  DQ350260;  DQ350259;  DQ350258; DQ350257;DQ350256; DQ350255; DQ350271; DQ350270 và U83876)

Trong khoảng hơn 4.000 đối tượng lựa chọn ngẫu nhiên trong đợt điều tra cắt ngang vào tháng 12/2004, được sàng lọc bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu loài (SS- PCR) phát hiện 4 chủng ký sinh trùng sốt rét thường gặp ở người (P. falciparum, P. vivax, P.malariae. P. ovale),  có 95 trường hợp  được chọn ngẫu nhiên để sàng lọc tìm P.knowlesi từ 210 trường hợp nhiễm P.malariae đơn thuần hay phối hợp. Trong 95 trường hợp này có 41 trường hợp  nhiễm P.malariae đơn thuần, 15 trường hợp nhiễm phối hợp với P.falciparum, 15 trường hợp nhiễm phối hợp với P.vivax, 5 trường hợp nhiễm phối hợp với P.ovale, 10 trường hợp nhiễm phối hợp với 2 chủng  P.falciparum và P.vivax, 8 trường hợp nhiễm phối hợp với 2 chủng  P.vivax và P.ovale, 1 trường hợp nhiễm cả 4 chủng ký sinh trùng. Kết quả soi kính hiển vi 31 mẫu âm tính, 42 mẫu đơn nhiễm (22 P.falciparum, 19 P. vivax, 1 P. malariae, 11mẫu nhiễm phối hợp trong đó có 6 mẫu nhiễm phối hợp cả 3 chủng P. falciparum, P, vivax và P. malariae).

            Qua phân tích PCR, có 3 mẫu dương tính với P. knowlesi, các mẫu này đều được giải trình tự ADN, một trong những mẫu này vẫn dương tính với P. knowlesi 1 năm sau đợt điều tra (tháng 12 năm 2005) bằng cả 2 phương pháp PCR và giải trình tự ADN. Các trình tự (có kích thước 153 cặp bazơ) thu thập được tại Việt Nam tương đồng với chủng P. knowlesi của Malaysia đến 97-99% (FJ160750;FJ160751;FJ160752; FJ160753 và FJ871986 )

            Đối tượng nhiễm P.knowlesi gồm có một bé trai 2 tuổi, một bé gái 3 tuổi và một thanh niên nam 27 tuổi. Qua soi kính hiển vi, bé gái có lam máu dương tính với P.falciparum và P.vivax, người thanh niên dương tính với P.vivax và bé trai thì không phát hiện thấy ký sinh trùng sốt rét. Trong kỹ thuật PCR đặc hiệu với loài thì bé gái 3 tuổi nhiễm phối hợp P.falciparum, P.vivax và  P.malariae, bé trai 2 tuổi nhiễm phối hợp P.malariae và P.ovale, còn người thanh niên nam thì nhiễm phối hợp P.vivax và  P.malariae. Cả 3 bệnh nhân đều thuộc cộng đồng dân tộc thiểu số Ra-glây, sống gần rừng và đều không có triệu chứng lâm sàng của bệnh sốt rét khi được điều tra. Qua khai thác tiền sử bệnh, thanh niên nam có tiền sử nhiễm P. falciparum 6 tháng trước đợt điều tra (test chuẩn đoán nhanh RDT). Những người sống cùng nhà của các ca nhiễm P. knowlesi nói trên cũng được sàng lọc và 9 người cho kết quả dương tính với chủng ký sinh trùng này nhưng các mẫu dương tính không được giải trình tự ADN.

3. Bàn luận

Nghiên cứu này lần đầu tiên chứng minh trường hợp nhiễm tự nhiên P.knowlesi ở người tại vùng rừng núi của một tỉnh miền Trung Việt Nam. Khác với các báo cáo tại các nghiên cứu khác, phần lớn các đối tượng nghiên cứu đều là người lớn, có các triệu chứng lâm sàng điển hình thậm chí có mật độ ký sinh trùng cao khi soi kính hiển vi. Trong nghiên cứu này tất cả các ca nhiễm P. knowlesi đều không có triệu chứng lâm sàng trong suốt đợt điều tra, có phối hợp với nhiễm P.malariae, mật độ ký sinh trùng thấp, hai trong ba trường hợp phát hiện xảy ra trên trẻ  tuổi còn rất nhỏ (<5 tuổi). Mặc dù các trường hợp nhiễm P. knowlesi  nói trên được phát hiện qua phân tích các mẫu giấy thấm trong điều tra nghiên cứu cắt ngang nên các đối tượng này không được theo dõi chặt chẽ sau nghiên cứu tuy nhiên kết quả này cũng góp phần phản ánh chùng ký sinh trùng này không thực sự hiếm như chúng ta  vẫn nghĩ tại miền trung Viet Nam nơi mà trẻ em cũng có thể bị tái nhiễm và có khả năng sống chung hoà không biểu hiện triệu chứng lâm sàng.

 Hạn chế của cặp mồi Pkm8 vàPkm9 trong quy trình PCR của Singh. B là  đôi khi có thể gây ra phản ứng chéo giữa  P. knowlesi và P. vivax đã  được báo cáo trong nghiên cứu của Mallika Imwong và cộng sự năm 2009 [6], tuy nhiên trong nghiên cứu này AND của cả 3 ca nhiễm P. knowlesi đều được nhân dòng  và giải trình tự để chứng minh sự tồn tại thực sự của ký sinh trùng, các trình tự ADN thu được  tại các mẫu thu thập tại Ninh Thuận, Việt Nam giống với  trình tự của 18S P. knowlesi típ SSUrRNA  ((FJ160750;FJ160751;FJ160752; FJ160753 và FJ871986 ) mang các đặc điểm khác biệt và nhưng giống 97-99%  với các trình tự thu được tại Malaysia (DQ350263; DQ350262; DQ350261;  DQ350260;  DQ350259;  DQ350258; DQ350257;DQ350256; DQ350255; DQ350271; DQ350270 và U83876) và khác biệt hoàn toàn với trình tự ADN của P. vivax (Hình 1)

Hơn nữa trong khu vực nghiên cứu đã xác định sự có mặt của các véc tơ sốt rét Anopheles dirus sensu stricto, Anopheles minimus, Anopheles maculatus và Anopheles jeyporiensis, véc tơ Anopheles dirus ss thuộc nhóm Anopheles leucophyrus. Gần đầy một nghiên cứu khác đã phát hiện P.knowlesi trong một cá thể  Anopheles dirus tại tỉnh Khánh Hòa giáp tỉnh Ninh Thuận, chứng tỏ P.knowlesi có thể được truyền bởi Anopheles dirus.  Đồng bào dân tộc Ra-lay có lối sống phụ thuộc vào thiên nhiên, ăn rừng ngủ rẫy, phân bố hộ gia đình rải rác, không cố định, trình độ tỷ lệ hộ nghèo cao, dân trí thấp [7], trong khi đó khỉ đuôi dài- vật chủ truyền P. knowlesi  từ khỉ sang người qua nhóm Anopheles leucosphyrus đôi khi được nuôi như sinh vật trong nhà, đây là một trong những nguyên nhân làm tăng nguy cơ mắc bệnh.

Ngoài những đóng góp nêu trên, nghiên cứu này còn chứng minh tỷ lệ nhiễm P.malariae không thấp tại miền trung Việt Nam, các trường hợp nhiễm phối hợp cũng không ít như qua soi lam máu dưới kính hiển vi, một lần nữa xác nhận lại sự hiện diện của  P.ovale tại Việt Nam, mà biện pháp soi trên kính hiển vi lam máu nhuộm Giemsa chưa phát hiện được.

Việc phân lập chuỗi DNA của P.knowlesi trong số các mẫu được phân lập cho thấy rằng phân tích trình tự AND sẽ là hữu ích trong việc làm rõ về dịch tễ học và tiến triển của bệnh sốt rét do P. knowlesi ở con  người.

Neighbour-joining tree based on the 18S SSUrRNA gene sequences of P. knowlesi, P. vivax and other plasmodium.

THE FIRST  REPORT ON HUMAN PLASMODIUM KNOWLESI  INFECTION

IN VIET NAM

Hong Nguyen Van, Peter Van de Eede, Chantal Overmeir, Thanh Pham Vinh, Thang Ngo Duc,Le Xuan Hung,  Nguyen Manh Hung,  Umberto D’Alessandro  and Annette Ehart

Abstract

In the last 20 years, the number of the reports of human infection with Plasmodium knowlesi  is increasing considerably in Southeast Asian countries. In Viet nam, 2009, Shusuke Nakazawa’s research group also reported Anopheles dirus infects with P. knowlesi, P. knowlesi malaria has become a hot topic attracting attention of scientific community not only in Vietnam but also over the world.

 Among 95 blood samples tested positive for P. malariae  by species – specific PCR  were collected from local residents in the large cross-sectional malaria surveys in  Ninh Thuan province in 2004, 3 (3.1%) samples were confirmed positive with P.knowlesi by  PCR (a girl aged 2, a 3 year olds and a young man). All of them were confirmed by sequencing. The sequencing results illustrate that there was a similarity between sequences obtained from Vietnamese samples and Malaysian samples with 97- 99%. Interestingly, the young girl was again found positive by PCR for P. knowlesi after one year for both methods: PCR and sequencing.